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口腔菌群想要突破?這一方法潛力無限

2021-02-07 00:00:00健康

編者按:

過去二十年的研究已經產生了許多口腔微生物組的資料,這些資料描述了健康或疾病狀態下宿主和口腔微生物組的遺傳學和生理學。

儘管,到目前為止,宿主-口腔微生物組的相互作用研究已經取得了重要進展,但是,我們依然無法確定與從口腔健康到生態失調關鍵轉折點相關的生物標誌物。

那麼,未來我們應該如何更加高效地研究宿主-微生物組間的互作呢?今天我們共同關注口腔微生物組,希望本文能夠為相關的產業人士和諸位讀者帶來一些幫助和啟發。

要點

●我們迫切需要更好地瞭解健康的和具有恢復力的口腔生態系統是由什麼組成的。

●縱向研究對瞭解如何抵抗口腔疾病並恢復正常狀態是至關重要的。

●數學建模方法在解釋複雜的縱向資料和確定健康-疾病閾值的關鍵生物標誌物方面有很大的前景。

口腔菌群與疾病

一百多年來,人們一直在深入研究口腔菌群,旨在瞭解疾病的狀態和疾病是如何產生的。[1]然而,在我們完全認識疾病之前,有必要對口腔健康設定一個明確的定義,包括臨床症狀和病徵,以及與健康相關的關鍵生物標誌物譜。

口腔是一個複雜的生態系統,潛在的生物標誌物包括宿主免疫、生物化學介質以及棲居在口腔不同部位的菌群。[2,3]

大規模識別關鍵因素,有助於維持口腔健康。這種識別需要自上而下的整體方法,以同時監測在人類口腔複雜環境中的多種因素。

例如,對 268 名健康成年人唾液中的生化、代謝和微生物成分的分析表明,在口腔健康中存在多種生態狀態或「生態型(ecotypes)」。[ 4]目前尚不清楚這些生態型是否與口腔疾病易感性增加有關。此外,目前尚不清楚生態型如何隨著正常的衰老過程而變化。但有證據表明,宿主的免疫反應和口腔微生物組在整個生命過程中都會不斷變化。[5,6,7]因此,在不同年齡組的個體中很可能會發現其他的生態型。

儘管已經進行了大量的研究,以確定與口腔健康或疾病相關的關鍵物種,但在確定健康或疾病狀態方面,微生物組發揮的整體功能可能比具體的組成更重要。有人提出,與健康相關的口腔微生物組可能需要一套核心功能,就像人類健康需要一套核心基因一樣。[7,8]

現在已經確定,牙菌斑相關的疾病,如齲齒和牙周炎,與疾病部位的口腔微生物組的改變有關。這一基本概念可以追溯到 Marsh 等人於上世紀 90 年代提出的「生態菌斑假說(Ecological Plaque Hypothesis)」。

這一假說的提出是為了使之前相互矛盾的觀點合理化,即(1)特定的菌種(病原體)是導致牙菌斑介導疾病的原因;(2)導致疾病的原因是牙菌斑的數量,而不是具體的菌種。[9,10,11]

根據生態菌斑假說,疾病的發展由最初的幹擾開始,然後透過選擇有助於疾病過程的微生物物種來進一步擴大幹擾。

在齲齒的情況下,這一過程是由過量或頻繁的糖攝入量驅動的。這一行為首先選擇了中度產酸的屬,如鏈球菌或放線菌,然後進一步在牙菌斑形成的區域性環境中促進酸的產生。[12]最終,種群富集了更多產酸的物種,如變異鏈球菌或假絲酵母。[13,14]此外,變異鏈球菌還能從蔗糖中產生不溶性葡聚糖,從而在牙齒表面附近形成區域性低 pH 值環境。[15,16]

在牙周炎中,細菌和宿主之間的相互作用對疾病至關重要。通常來說,牙菌斑在牙齦邊緣的積累被認為是引發炎症的主要原因。[9]從牙齦炎到牙周炎的轉變與菌群中革蘭氏陰性厭氧菌的蛋白水解有關,包括牙齦卟啉單胞菌、連翹坦氏菌和牙根密螺旋體,以及革蘭氏陽性厭氧菌,如Filifactor alocis和多種其他物種。[1,17,18]

Hajishengallis 等人利用牙周炎小鼠模型證明瞭,即使牙齦卟啉單胞菌在口腔微生物組中含量很低,也能誘導產生強烈的病原宿主反應。[19]

他們將該物種命名為「關鍵病原體」,因為它對疾病的影響與其在微生物組中的豐富程度不成比例,[20]並且提出了一個模型:共生微生物組包括與疾病不相容的物種,以及在存在風險因素的情況下,可能會透過與關鍵病原體的相互作用促進疾病的物種。而後者可能會觸發宿主的變化(炎症,就牙齦生物膜而言),然後進一步選擇致病菌。最終導致微生物的失調和破壞性的宿主反應。[20]

雖然這些模型提供了口腔健康和疾病之間區別的廣泛觀點,但它們目前專注於從微生物種類的角度來解釋疾病,而不是這些物種所具有的功能。此外,目前的模型還不能解釋對耐受齲病或牙周病驅動因素的個體間差異。[21]

口腔疾病的風險會隨著時間發生巨大的變化。齲齒是廣泛流行的,甚至在年輕人之中,而嚴重牙周炎的流行率則隨年齡增加,且男性似乎高於女性。[22]

在某些疾病中,疾病的某些表徵與特定的生命階段有關。例如,兒童早期齲病是一種侵襲性的疾病,會影響到初期乳牙列,而牙根齲齒則發生在生命的後期。[23,24]

同樣,C 級牙周炎(以前稱為「侷限型侵襲性牙周炎」)往往會在青春期前後(11~13歲之間)形成。[25]

齲齒和牙周炎的危險因素是複雜的,年齡如何影響宿主-微生物相互作用還不完全清楚。

兒童早期齲病、牙釉質缺陷和可改變的危險因素(如糖的攝入和低氟接觸)會影響早期疾病的發展。[26]相比之下,免疫系統的衰老與衰老過程中發生的低程度炎症被認為會影響牙齦下的微生物組引起的牙周炎疾病的結果,並可能導致老年人疾病的增加。[7,27]

然而,目前有限的證據表明,衰老並沒有在很大程度上直接改變口腔微生物組。[27]口腔微生物組在沒有嚴重幹擾的情況下短期內依然可以保持相對穩定。[28]

人們通常認為微生物組是動態的,其穩定性是由對抗變化並不斷恢復系統的內在因素維持的。[29]微小的幹擾可以在系統的自然動態中被接受。抵抗變化的能力將取決於個體。如果擾動克服了這種自然抗性,系統就會脫離其自然的內穩態。個體面臨的挑戰是恢復健康,並阻止向生態失調或疾病方向發生轉變。恢復到原始狀態或另一種與健康相關的穩定狀態的自然能力稱為「恢復力」(圖 1)。

在最近一篇精彩的綜述中,Rosier 等人討論了一些可能決定口腔微生物組恢復力的機制。[30]這包括微生物群落固有的機制(如噬菌體和抗菌素的產生,包括細菌素和過氧化氫,介導微生物間競爭),以及宿主免疫和環境調節因子,如營養和生長因子。

當前,已經有人建立了體外和動物模型來研究這些因素對預防或逆轉微生物失調和/或口腔疾病的影響。[31,32]然而,這些模型對系統中那些只有在存在相互作用時才變得重要或更重要的組分的描述能力是有限的。

此外,儘管在開發免疫系統成分和微生物組的「人源化」模型方面已經取得了進展,但是動物模型永遠不會完全複製人類生物學的所有因素。[33,34]因此,仍然有必要開展人體臨床研究,以增加對有助於口腔健康的口腔生態系統的關鍵特徵整體的理解。

抵抗力和恢復力是具有時間性的概念,不能透過橫斷面研究來完全理解。然而,除了特徵明確的實驗性牙齦炎模型,[35]僅有較少的研究探究了齲齒或牙齦炎/牙周炎發病過程中,口腔微生物組或者宿主炎症調控因素的縱向變化。

因此,目前還沒有強有力的生物標誌物可以區分不同程度的抵抗力或恢復力,也缺乏解釋這些差異的機制基礎。

圖1.口腔生態系統的抵抗力和恢復力。a)在健康狀態下,齦上(黃色)和齦下(藍色)牙菌斑微生物處於穩態。b)每個人都有抵抗病原體變化的能力,這些變化會導致齲齒(灰色的小區域表示早期病變)或牙齦炎(牙齦組織變紅)的早期表徵。這些改變與微生物組的變化有關。c)能夠逆轉齲齒或牙齦炎的早期跡象並恢復口腔健康的能力被稱為恢復力。這伴隨著牙菌斑微生物組的恢復。d)如果早期變化不能逆轉並且持續暴露於促疾病因素中,隨之而來的是不可逆的損害,表現為更嚴重的齲齒病變(牙齒上的黑色區域)或牙周炎(表示為發紅/發炎和牙周袋的存在)。與疾病相關的微生物組也會處於營養不良狀態。

縱向研究的證據

雖然對於抵抗力和恢復力的生物標記物是迫切需要的,但解釋這些標記物的功能往往不是簡單的。

雖然渴望識別發生在齲齒或牙周病變的起始部位的宿主和微生物的變化,但是目前這幾乎是不可能實現的,因為這需要在很長一段時間內從許多志願者口中的多位點進行取樣。

因此,大多數關於牙周炎微生物學的縱向研究都集中在疾病已經存在的部位,並評估治療的反應,而不是疾病的發展。[36,37]

正如 Rosier 等人指出,微生物對先天免疫系統其他方面的影響還可以根據物種是否與健康和疾病相關進行不同的解釋。

比如,儘管牙齦卟啉單胞菌和唾液鏈球菌都會抑制 IL-8 的分泌,但是對於病原體牙齦卟啉單胞菌而言,這一機制被認為有助於提高毒性,[38]而對於口腔共生菌——唾液鏈球菌來說,抑制 IL-8 的分泌卻被認為可以防止不必要的和破壞性的炎症,並有助於體內平衡。[39]

然而,在健康狀態下,牙周也存在較低水平的牙齦卟啉單胞菌,在這種情況下,抑制 IL-8 的產生可能也有助於維持體內平衡。

此外,有證據表明,某些微生物在從健康過渡到疾病過程中的作用可能是僅在某一特定人群中發生,而不是普適性的。[40]這些複雜性使得我們很難找到一種能夠確定健康和不可逆轉疾病之間的臨界點的生物標誌物。

早期調查齲齒病微生物學的縱向研究依賴於微生物培養,對微生物組進行整體取樣的能力有限。[41,42,43]最近,大量關於齲齒的縱向研究已經採用了不依賴培養的微生物組分析方法。[44,45,46]由於該方法的成本和敏感性的限制,這些研究迄今為止使用的是積聚的菌斑,而不是從齲齒髮展過程中的特定部位分離出來的菌斑。因此,齦上牙菌斑的種群的改變似乎是發生在齲齒髮展之前。

牙周疾病的早期階段可以用「實驗性牙齦炎」方法在人體上進行實驗模擬,該方法由 L?e 等人在 20 世紀 60 年代首創。[47]

我們最近回顧了實驗性牙齦炎的抵抗力和恢復力的證據,[35]發現免疫、生物化學和微生物生物標誌物的波動在口腔的各個不同階段和挑戰中均得到鑑定。

在某些情況下,生物標誌物的趨勢似乎與恢復力有關。例如,據報道,乳鐵蛋白在實驗性牙齦炎期間濃度增加,並在疾病消退後恢復到基線水平。

但是,總的來說,本綜述涵蓋的研究很少調查了牙齦炎後的恢復階段,因此,尚不清楚哪些因素有助於恢復力。

數學建模:機遇和挑戰

體內實驗研究面臨許多挑戰,包括參與者的可用性、倫理規定、成本、延長時間來研究疾病發作或臨床結果,以及它們在可篩查的條件範圍內受到限制的現實。此外,通常很難或不可能直接在人體實驗物件中確定機制。[48]

數學建模是研究口腔生態系統挑戰的一種有前景的方法。[49]模型已經在微生物生態學中使用了很長時間。[50]

模型可以模擬任何可行的口腔生態系統或環境,以確定哪些引數(生物標誌物)對結果有最大的影響。例如,模型可以在任何時間採用假設的營養方法進行幹預來研究幹擾因素(例如,持續高/頻繁的糖攝入量),而不必擔心研究參與者。模擬的結果可以給定向的體內實驗提供指示。

Dibbin 和 Reece 開創了牙科數學建模的先河。[51]在接下來的幾十年裡,數學模型被用來研究齲齒[52,53,54]和牙周炎的進展。[55,56]這些例子涵蓋了各種模型型別,模型的選擇應該與所提出的問題相匹配。[49,57]

口腔菌群是一個生物之間以及生物與環境之間存在動態多尺度、時空相互作用的複雜生態系統。對於不依賴於牙菌斑物種間空間排列的問題,可以使用連續模型。[52,58]

Ilie 等人的研究中,選擇了四類微生物作為主要菌斑成分(酸性尿鏈球菌,非酸性尿鏈球菌,放線菌和韋榮氏球菌屬)。這項研究主要探究了不同因素對 pH 值和牙齒脫礦質的影響。

在不存在韋榮氏球菌屬的情況下,模型預測結果顯示 pH 會降低。微生物活性,而不是牙齒脫鹽釋放的磷酸鹽的緩衝作用可以更好地解釋 pH 的變化。這樣的結果表明韋榮氏球菌屬或其他消耗乳酸的細菌的存在是有恢復力或健康的生態系統的重要指標。

但是,在解釋資料時應格外小心,因為在實驗中,經常觀察到在齲齒中韋榮氏球菌屬增加,並且可能支援產酸物種(例如變異鏈球菌)的生長。這強調了在實驗或臨床研究中驗證的必要性,以及進一步加深對相關機制的理解的重要性。

連續模型不能用於展現牙菌斑內的空間競爭,pH 梯度或牙菌斑對牙齒的區域性作用。多智慧體模型(Agent-based models)更適合於這種型別的問題,儘管它們具有複雜性高和計算需求高的缺點。[54,59,60]

Papantonoupoulos 等人[55,56]使用基於智慧體的或細胞自動機模型來模擬牙周炎疾病的進展及其動態特性。他們的結果表明牙周炎是一個非線性的,混亂的動態過程,在其中宿主免疫反應控制其發展率。

其中一個模擬發現是,當宿主免疫反應增加時,牙周炎發展率降低。透過臨床和免疫學資料對模型進行驗證,資料符合兩種不同的臨床表現,分別為侵襲性牙周炎或慢性牙周炎。

連續模型和基於智慧體的模型基於第一原理(first principles)。

另一種方法是「黑匣子」模型,如人工神經網路(ANNs),它使用現有資料作為訓練集,開發出可以預測結果的模式。例如,ANNs 可以透過利用患者的免疫反應圖譜,來區分兩種型別的牙周炎。[61]

人工智慧的方法最近有了巨大的新進展,[62,63]但是需要更多的資料,並依賴協調的國際合作來開發全球資料庫儲存庫。將這些方法用於新的牙周分類方案中[64],以確定它們是否能夠區分疾病的分期或分級,這將是很有趣的。

基於這些例子,我們提出也可以建立用來估計截斷點或臨界值的模型,也就是判斷口腔生態系統將從穩態(在擾動挑戰期間)轉變為紊亂狀態的模型。

建模的好處是可以建立一個研究閉環來定義研究目標和結果變數(見圖 2)。

首先,一個假設可以在一個數學模型中用現有的證據來檢驗。這些引數可以用來確定生態系統從一種狀態切換到另一種狀態的截止點。並且,可以用由模型提供的方法在體內驗證結果。

然後,體內研究結果會提供新的證據和引數,用作輸入值或產生新的研究問題,以建立模型。

儘管任何模型都有侷限性(例如,簡化假設),但在數學模型中探索生態系統的變化是一種廉價的方法,可以用來檢驗假設,並確定未來的研究方向,以進一步確認模型的結果。

圖2. 數學建模的研究閉環導致研究建立

結論

儘管許多研究已經調查了與齲齒或牙周疾病相關的微生物和宿主因素,但我們距離實現人類健康還有很長的路要走。特別是,我們尚不知曉個體抵抗或從齲齒或牙周疾病刺激中恢復的能力。

在這一領域,迫切需要進行額外的縱向研究。數學建模在指導這些研究和建立可檢驗的假設方面具有巨大的潛力。但是,研究將需要多次測量宿主和微生物因素,以提供足夠的資訊來理解微生物組在響應誘導疾病刺激時的動態變化。

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